پایان نامه ارشد درمورد چهارمحال و بختیاری، دانشگاه ارومیه، استان کرمانشاه، استان کرمان

بین جمعیتهاست(28).

1-18 بررسی تنوع و تفاوت ژنتیکی بین جمعیتها براساس آنالیز Nei
جهت کمی نمودن تمایز درون و بین جمعیتها از آنالیز Nei استفاده میشود که از سه ضریب متفاوت تشکیل شده است:
تنوع ژنتیکی کل جمعیتها HT
تنوع ژنتیکی درون جمعیت HS
تنوع ژنتیکی بین جمعیتی GST
این سه برآورد به صورت زیر به هم مرتبط هستند:
GST=(HT – Hs)/HT
نهایتا با استفاده از فرمول زیر جریان ژنی (Nem) نیز محاسبه میگردد که متوسط مهاجرت در هر نسل را نشان میدهد(28):
Nem=0.5(1 – GST)/GST
این معیار برای اندازه گیری فاصله ژنتیکی بین جمعیت ها کاربرد فراوانی دارد.
1- 19 سابقه تحقیق
1- 19- 1 مروری بر برخی پژوهشهای علمی انجام شده بر روی Quercus brantii Lindl.
درحال حاضر عمده مطالعات صورت گرفته بر روی Quercus brantii Lindl. در داخل کشور، معطوف به ترکیبات، اسانس و اسیدهای چرب و اثرات درمانی بوده است. در این گونه در رابطه با بررسی روابط فیلوژنتیکی توسط مارکرهای مولکولی کارهای بسیار کمی صورت گرفته است، مشایخی و همکاران در سال 1389 بهوسیله مارکرAFLP هشت جمعیت از Quercus brantii Lindl. در استان چهارمحال و بختیاری را از لحاظ روابط ژنتیکی مقایسه کردند. نتایج آنها نشان داد که در استان چهارمحال و بختیاری سطح بالایی از تنوع بین و درون جمعیتهای بلوط ایرانی وجود دارد(9).
ذوالفقاری و همکاران از تکنیکSSR برای بررسی تنوع و روابط ژنتیکی بین جوامع مختلف ارتفاعی بلوط ایرانی در استان کهکیلویه و بویر احمد استفاده کردهاند و به این نتیجه رسیدهاند که بلوط ایرانی در این جوامع از تنوع ژنتیکی بالایی برخوردار است و ارتفاع تاثیر جالبتوجهی بر این تنوع دارد. به طوری که جوامع مستقر در ارتفاعات پایینتر از لحاظ ساختار ژنتیکی تفاوت معنیداری با جوامع موجود در ارتفاعات بالاتر دارند و کمترین فاصلهژنتیکی نیز بین درختان طبقه ارتفاعی بالا و خیلی بالا وجود دارد و مارکر SSR به دلیل پلیمورفیسم بالایی که نشان داد مارکری کارآمد برای بررسی این گونه از بلوط میباشد(3).
از آنجایی که بلوط ایرانی اندمیک ایران و ترکیه میباشد در خارج از کشور ایران هیچ مطالعهای بر روی ژنوم و تنوع جمعیت بلوط ایرانی انجام نشده است.
مطالعات دیگری نیز بر روی سایر گونههای بلوطQuercus در بیشتر نقاط دنیا انجام شده است چرا که این گیاه از لحاظ اکولوژیکی، اقتصادی و … حائز اهمیت است و همه این تحقیقات نشانگر وجود تنوع ژنتیکی بالا در بین و درون جمعیتهای بلوط میباشد.(14و5)

1-19-2- مروری بر برخی پژوهشهای انجام شده با استفاده از نشانگرSRAP
مارکر SRAP یک مارکر جدید است که تاکنون مطالعات زیادی در رابطه با این مارکر در داخل کشور انجام نشده است.
عابدیان و همکاران در سال 2012 تنوع بین گونهای چند گونه از گیلاس را با استفاده از این مارکر بررسی کردند که پلیمورفیسم نسبتا بالایی را نشان داد و این اولین گزارش مارکر SRAP در گیلاس بود(13). طالبی و همکاران نیز تنوع بینگونهای چند گونه از پسته در ایران را با استفاده از این مارکر بررسی کردند و پلیمورفیسم بالایی را مشاهده نمودند(60).
در خارج از کشور مطالعات زیادی با استفاده از این مارکر بر روی گیاهان مختلف انجام شده است، لی وانگ و همکاران در سال 2008 تنوع ژنتیکی تربچه را با استفاده از مارکرهایSRAP، ISSR، RAPD ارزیابی کردند و درصد پلیمورفیسم مارکرSRAP حدود 85% بود که مقداری قابلتوجه است(38).
یانگ و همکاران در سال 2012 با استفاده از این مارکر تنوع ژنتیکی درون گونهای درخت کنار را بررسی کردند که پلی مورفیسم بالایی را نشان داده و بسیار کارآمد بوده است(73).
یوجن و همکاران در سال 2010 با استفاده از این مارکر و مارکرSSR تنوع ژنتیکی بین و درون جمعیتهایPogostemon cablin را در چین بررسی کردند. که در این مورد نیز نتایج جالب توجهی به دست آمد و پلی مورفیسم خوبی را نشان داد(75).
زیاوپنگ و همکاران در سال 2008 تنوع ژنتیکی گونه های میخک را با استفاده از این مارکر بررسی کردند(70).
گااو و همکاران در سال 2005 تنوع ژنتیکی بینگونه ای 22 گونه از Hedychium چینی را با استفاده از این مارکر بررسی کردند و آنها را در 3 دسته طبقه بندی کردند و نقشه ژنتیکی آنها رسم شده است(22).
حمدی عمر و همکاران در سال 2011 تنوع ژنتیکی 24 گونه از Citrus را با استفاده از این مارکر و مارکرهای SSR و CAPS-SNP بررسی کردند و براساس نتایج مارکر SRAP کارآمدترین مارکر گزارش شد زیرا درصد پلیمورفیسم آن از دو مارکر دیگر بیشتر بود(27).
وانگ و همکاران در سال 2011 تنوع ژنتیکی 68 گونه کرفس و گونههای مرتبط با آن را با استفاده از مارکرهای SRAP و SSR بررسی کردند. پلیمورفیسم حاصله 95% بود که نشاندهندهی کارآمد بودن هر دو مارکرSRAP و SSR جهت بررسی کرفس و گونههای مرتبط بود(67).
کای و همکاران نیز در سال 2011 تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیتی یک نوع ارکیده در حال انقراض را با استفاده از مارکر SRAP بررسی کردند درصد پلی مورفیسم81% درصد محاسبه شد و مشخص شد که این گیاه دارای تنوع ژنتیکی بالایی در سطح گونه است(17).
ییلدیز و همکاران در سال 2011 از سه مارکر ISSR، RAPD و SRAP جهت بررسی تنوع ژنتیکی 63 ژنوتیپ هندوانه ترکی استفاده کردند. میانگین درصد پلیمورفیسم 90% بود که این میزان نسبت به مقادیر قبلی به دست آمده در جهان بیشتر بود(74).
پنگ و همکاران نیز در سال 2008 تنوع ژنتیکی 23 جمعیت از گلرنگ ( (Carthamus tinctoriusو گونه های مرتبط با آن را با استفاده از مارکر SRAP بررسی کردند که پل مورفیسم نسبتا بالایی (57%) را نشان داد(46).
دانگ و همکاران در سال 2010 تن
وع ژنتیکی 15 جمعیت نوعی از گندم سرخ وحشی در اسرائیل را با این مارکر بررسی کردند و درصد پلیمورفیسم 79% محاسبه شد(19).
شاو و همکاران در سال 2010 تنوع ژنتیکی 29 جمعیت گل داوودی را براساس مارکرهای SRAP و ISSR بررسی کردند. پلی مورفیسم محاسبه شده توسط ISSR بیشتر از SRAP بود ولی با این حال پلیمورفیسم SRAP مقدار قابل توجهی (75%) بود(54).
لیو و همکاران در سال 2012 تنوع ژنتیکی 14 جمعیت وحشی از گرگتیغ (Lycium ruthenicum Murr) را با استفاده از این مارکر بررسی کردند که در سطح گونه پلیمورفیسم بالایی مشاهده شد و درصد پل مورفیسم درونگونهای 84% بود اما پلیمورفیسم بینگونهای 15% بود و درنتیجه تمایز ژنتیکی متوسطی بین جمعیتها وجود داشت(37).
لیائو و همکاران در سال 2012 تنوع ژنتیکی 25 جمعیت وحشی و یک جمعیت زراعی Prunella vulgarisرا با استفاده از این مارکر بررسی کردند و درصد پلیمورفیسم حدود 88% محاسبه گردید و جمعیتها در سه گروه دستهبندی شدند(33)

مطالعات درون گونهای و بینگونهای دیگری نیز بر روی Cynodon radiatus(29) Ziziphus (34)Coffea arabica (Rubiaceae) (41) با استفاده از مارکر SRAP انجام شده است که پلیمورفیسم محاسبه شده قابلتوجه بوده است.
همانطور که گفته شد در تمامی مطالعات انجام شده توسط مارکرSRAP چه بر روی گیاهان علفی و چه بر روی گیاهان درختی و درختچهای و به ویژه خانوادهFagaceae پلیمورفیسم حاصله بالا بوده و این مارکر یک مارکر کارآمد میباشد.
تاکنون تنوع ژنتیکی هیچ گونهای از Quercus با این مارکر بررسی نشده و این اولین گزارش میباشد.

فصل دوم:
مواد و روش ها
2-1 انتخاب مناطق و جمعیتها
به صورت تصادفی 5 منطقه در طول زاگرس از استان کرمانشاه تا استان فارس مشخص شدند که اسامی این مناطق و عرض و طول جغرافیایی آنها در جدول آمده است (جدول2-1).

جدول 2-1 اسامی جمعیت ها و مناطق بررسیشده در این تحقیق
کد
محل اصلی
ارتفاع از سطح دریا
عرض جغرافیایی
طول جغرافیایی
POP1
یاسوج
1950
30 35.791 N
51 31.908 E
POP2
برمدشت- کازرون
1370
29 33.166 N
51 52.822 E
POP3
بیستون- کرمانشاه
1490
34 22.497 N
47 16.663 E
POP4
آبدانان- ایلام
1660
33 04.170 N
47 19.201 E
POP5
خوزستان
2040
32 45.79 N
48 58.50 E

شکل2- 1 جمعیتها و مناطق بررسی شده در این تحقیق

2-2 جمع آوری و آماده سازی نمونه های گیاهی
در هر منطقه به طور متوسط 10 پایه به صورت تصادفی انتخاب شد که فواصل آنها از یکدیگر حداقل 50 و حداکثر 100 متر بود و به هر پایه یک کد داده شد .
در بهار 1391 نمونههای برگ تازه از قسمت سرشاخه برداشت شد و در درون کیسههای پلاستیکی به همراه سیلیکاژل قرار داده شد و بر روی یخ به آزمایشگاه منتقل شد.
در آزمایشگاه برگهای تازه و جوان (شکل2-2) پس از پوشاندهشدن با آلومینیوم فویل در درون نیتروژن مایع36 قرار گرفتند سپس به فریزر 80- درجه سانتیگراد منتقل گردیده و تا زمان انجام آزمایشات در آنجا نگهداری شدند.

شکل2-2 نمونههای برگ تازه در آزمایشگاه

2-3 استخراج DNA از نمونههای گیاهی
2-3-1 آماده کردن نمونهها
در پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه نمونههای برگی در هاون چینی همراه نیتروژن مایع بطور کامل پودر شدند. سپس به تیوبهای میکروفوژ37 استریل ml 5/1 منتقل شده و تا زمان استفاده در فریزر 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
2-3-2 استخراج DNA
استخراج DNA از بافتهای برگی پودر شده و به روش CTAB38صورت گرفت (40).

2-3-2-1 مواد موردنیاز
جهت تهیه محلول CTAB:
مقدار
ماده
2 %
CTAB
mM , pH=8 1/0
Tris-base
mM 5
EDTA
M 5/1
Nacl
4 %
β- mercaptoethanol
2 %
Polyvinyl pyrolidone

محلول بافرx) 10TBE ( :
مقدار
ماده
g 108
Tris base
g 55
Boric acid
g 3/9
EDTA

برای تهیه این بافر، مواد با آب مقطر حل شده و حجم آن به یک لیتر رسانده شده و بعد از اتوکلاو، در دمای اتاق نگهداری شدند.
محلول بافر x) 5/0TBE (
برای تهیه این بافر 50 میلی لیتر از x )10TBE( به 950 میلی لیتر آب مقطر اضافه شد(40).
ژل آگارز
این ژل معمولاً به میزان 1% تا 3% در بافرهای مختلفی مانند TAE، TBE تهیه میشود. برای تهیه ژل آگارز 1% 2 g از آگارز با10 میلیلیتر بافر x) 10TBE ( مخلوط شد و بعد حجم آن با آب مقطر به 200 میلیلیتر رسانده شد. به مدت 5 دقیقه در داخل مایکروویو حرارت داده شد تا بجوش آید و آگارز حل شود. مدتی پس از سرد شدن lμ 8 اتیدیوم بروماید به آن اضافه گردید(40) .

2-3-2-2 روش کار
1- 2/0گرم از بافت برگی پودر شده در میکروتیوب ریخته شد.
2- مقدار 700 میکرولیتر از بافر CTAB به پودر برگ اضافه شد سپس به کمک ورتکس یا تکان دادن بهم زده شد و حدوداً تا2 ساعت داخل بنماری 60 درجه قرار داده شد و هر 5 دقیقه یک بار تکان داده شد.
3- مقدار 700 میکرولیتر از محلول کلروفرم-ایزوآمیل الکل 24:1 به آن اضافه کرده و خوب محلول را تکان داده تا به رنگ شیری درآید.
4- سپس آنرا در rpm 13000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کرده و این مرحله بسته به شفافیت محلول رویی 2 تا 3 بار تکرار شد.
5- مایع زلال بالایی با استفاده از میکروپیپت برداشته شده و به تیوب میکروفوژ ml5/1 استریل منتقل گردید و به 3/2 حجم نمونه داخل تیوب محلول ایزوپروپانول سرد (نگهداری شده در 20- درجه سانتیگراد) اضافه شد و5 دقیقه خوب تکان داده شد.
6- محلول داخل تیوبها به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ (4 درجه سانتیگرادrpm 13000) شد تا DNA در کف آن رسوب نماید.
7- سپس مایع رویی را دور ریخته و رسوب DNA را با بافر شستشو (lμ 100 اتانول 70% و lμ 100 استات آمونیوم) 2 بار شستشو داده وگذاشته رسوب DNA خشک شود (
اتانول به طور کامل تبخیر شود).
8- در این مرحله، lμ100 RNasae رقیق شده به رسوب DNA اضافه کرده و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه در ترمومیکسر قرارگرفت.
9- به نمونهها lμ200، NaCl 5 مولار اضافه شد.
10- دو برابر حجم موجود در تیوب اتانول 100% اضافه شد (lμ100 RNasae +lμ200 Nacl).
11-نمونهها به مدت 20 دقیقه در فریزر 20- قرار داده شد.
12- نمونهها به مدت 5 دقیقه در دستگاه سانتریفوژ با دور rpm 13000 قرار گرفت.
13- مایع روئی بیرون ریخته شد و بعد رسوب DNA با lμ100 اتانول 70% شستشو داده شد.
14- درانتها، به رسوب DNA، lμ50 آب دیونیزه اضافه شد.
15- نمونهها به مدت 24 ساعت در دمای 20- درجه نگهداری شدند تا DNA به خوبی حل شود(40).

2-4 تعیین کیفیت وکمیت DNA:
2-4-1 استفاده از ژل آگـارز:
در این روش وضعـیتDNA از لـحاظ سالم بودن و نداشتن شکـستگی مـورد بررسی قرار گـرفت. در این روش 5 میکـرولیتر DNA پایه از نمونه استخراجی با 5 میکـرولیتر آب مقـطر مخلوط و به آن 3 میکـرولیتر لـودینگ بافـر اضافه و در ژل آگارز 1% به مدت 60 دقیقه با ولـتاژ ثابت 80 ولت الکـتروفورز گـردید. در نهایتDNAهایی انتخاب شدند که بر روی ژل آگارز تشکیل یک باند پر رنگ در بالای ژل دادند در صورتی که نمونه DNA دارای شکستگی باشد، بر روی ژل حالت اسمیر مشاهده میشود(40).

2-4-2 روش اسپکتروفتـومتری:
این روش بر مبنای اندازهگـیری طیف جذبی DNA توسط دستگاه اسپکـتروفتومتری میباشد(شکل 2-3). میزان جذب نور توسط اسیدهای نوکلیئک، پروتیئنها و ترکیبات فنلی به ترتیب در طول موجهای 260 ،280و 230 نانومتر صورت میگیرد و طول موج 320 نانومتر معرف میزان آلودگیها در نمونههای استخراج شده است. خلوص کیفیت DNA بر اساس نسبت طولموجهای 280/260 و 230/260 تعیین گردید چنانچه نسبت 280/260 در محدوده 2-7/1باشد، DNA از کـیفیت قـابل قبولی برخوردار خواهد بود، همچنین این دستگاه غلظت DNA (کمیت) را نیز نشان میدهـد.
غلظت DNA بر حسب نانوگرم در میکرولیتر از طریق فرمول زیر محاسبه شد:
50 ضریب رقتA260 A =غلظت DNA (نانو گرم در لیتر)

برای کالیبره نمودن دستگاه ابتدا درون کوئت ، 200 میکرولیتر آب دیونیزه ریخته و در دستگاه قرار داده شد پس از زدن کـلید
Blank زمانی که دستگاه عدد صفر را نشان داد کالیبره شده است. پس از کالیبره شدن، داخل کوئت، 198 میکرولیتر آب دیونیزه به همراه 2 میکرولیتر DNA استخراج شده ریخته و مقادیرA260 ، A280، A230 و غلظت بر حسب نانوگرم یـادداشت شد.در این پـروسه چون 2 میکـرولیتر از محلول پایهDNA در 198 میکرولـیتر آب دیـونیزه ریخته شد، پس محلول پایه 100 برابر رقیق شده است:
100 = 2/200 = ظریب رقت

در طول موج 260 نانومتر، OD مساوی یک برابر با 30 نانوگرم در میکرولیتر ds DNA Strand) (double است. جهت یکسان نمودن غلظت کلیه DNA پایه در واکنش PCR (30 نانو گرم در میکرولیتر)، DNA با نسبت معینی از آب دیونیزه که از فرمول زیر بدست می آی

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *