پایان نامه ارشد درمورد
دقیقه، lµ، 100%، Forward پایان نامه ها و مقالات

د رقیق شد:
C1V1=C2V2

C1= غلظت DNA در محلول پایه. V1 =حجم محلول پایه که باید برداشته شود. C2 =غلظت DNA در محلول مصرفی. V2 =حجم کل محلول که بایستی تهیه شود
نمونه های DNA‌ اصلی به دمای 20- درجه منتقل شدند.

شکل 2-3 دستگاه اسپکتروفتومتر برای تعیین کمیت DNA

2-5 واکنش زنجیره ای پلیمراز) (PCR :
واکنش PCR به کمک دستگاه ترموسایکلر انجام شد. حجم نهایی واکنش25 میکرولیتر بود. ترکیب مواد استفادهشده در PCR به شرح جدول (2-2) میباشد.
محلول پایه واکنش PCR، شامل همه مواد موردنیاز برای واکنش به جز نمونه DNA بود. ابتدا براساس تعداد نمونه DNAمورداستفاده در هر بار واکنش PCR، نسبتهای مشخصی از هر یک از اجزای واکنش برداشته شده و در یک تیوپ به خوبی با هم مخلوط گردید، سپس به مقدار 22 میکرولیتر از محلول پایه به هر یک از تیوپهایPCR که از قبل3 میکرولیتر از DNAموردنظر در آنها قرار داده شده است، اضافه گردید. تمامی مراحل آمادهسازی واکنش PCR برروی یخ صورت گرفت. تیوپهای PCR سپس در دستگاه ترموسایکلر(شکل2-4) قرار داده شدند و مطابق چرخه زمانی دادهشده به دستگاه ، واکنش PCR انجام شد. برنامه چرخههای دمایی واکنش زنجیره پلیمراز در جدول (2-3) آمده است. برنامه PCR بصورت time releaseانجام شد.
پس از اتمام PCR نمونه ها از دستگاه خارج و تا انجام الکتروفورز در یخچال نگهداری شدند(40) .
جدول 2-2 ترکیب مواد استفاده شده در PCR :
اجزاء واکنش
برای یک نمونه
بافرX 10
lµ 5/2
Forward primer
lµ 5/0
Reverse primer
lµ 5/0
dNTP
lµ 75/0
MgCl2
lµ 1
Taq polymerase
lµ 5/0
Distilled Water
lµ 25/16
DNA
lµ 3
Total
lµ25
جدول 2-3 برنامه PCR
سیکل
تکرار
دما
زمان
1
1
94
3 دقیقه
2
5
94
1 دقیقه

32
1 دقیقه

72
5/1 دقیقه
3
35
94
1 دقیقه

55
1 دقیقه

72
5/1 دقیقه
4
1
72
10 دقیقه
5

4

جدول 2-4 پرایمرهای مورد استفاده در آزمایش:
Sequence (5′-3′)
Type
Primer
5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′
Forward
ME1
5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′
Forward
ME2
5′-TGAGTCCAAACCGGAAT-3′
Forward
ME3
5′-TGAGTCCAAACCGGACC-3′
Forward
ME4
5′-TGAGTCCAAACCGGTGC-3′
Forward
EM8
5′-GACTGCGTACGAATTCAAT-3′
Reverse
EM1
5′-GACTGCGTACGAATTCGAC-3′
Reverse
EM3
5′-GACTGCGTACGAATTCTGA-3′
Reverse
EM4
5′-GACTGCGTACGAATTCGCA-3′
Reverse
EM6
5′-GACTGCGTACGAATTCTGC-3′
Reverse
EM2
5′-GACTGCGTACGAATTCGCC-3′
Reverse
EM18
5′-GACTGCGTACGAATTCTCA-3′
Reverse
EM19
5′-GACTGCGTACGAATTCTCC-3′
Reverse
EM20

تعداد 13 آغازگر از دسته آغازگرهای شرکت سیناژن مورد استفاده قرار گرفت (جدول2-4) این آغازگرها به صورت خشک فریز شده خریداری شدند که با آب دیونیزه استریل به غلظت pmol100 رقیق شده و در مقادیر کمتر در فریزر نگهداری شدند.

شکل2-4 دستگاه ترمو سایکلر مدل verity 96 well Thermal Cycler
2-6 الکتروفورز:
الکتروفورز یک روش آزمایشگاهی برای جداسازی مولکول های DNA و پروتئین است. برای انجام این روش از دستگاهی به نام دستگاه الکتروفورز (شکل2-5) استفاده می شود. تنوع زیادی در بین دستگاه های الکتروفورز وجود دارد، ولی هر دستگاه الکتروفورزی دارای اجزای میدان الکتریکی، منبع تغذیه و محیط تفکیک می باشد. وقتی مخلوطی از ذرات باردار در یک محیط الکتروفورزی قرار می گیرند، هر ذره باردار با یک سرعت خاص حرکت می کند و میزان حرکت هر ذره به قدرت میدان الکتریکی، اندازه، شارژ خالص ذره و نوع محیط هادی وابسته است. عمده ترین محیط های هادی مورد استفاده در سیستم الکتروفورز ژل آگارز، اکریلامید و نشاسته هستند. در منافذ این ژل ها بافر قرار می گیرد تا جریان الکتریکی هدایت شود و مولکول ها به راحتی مهاجرت کنند. این ژل ها در شکل ها، اندازه ها و همچنین تعداد منافذ مختلف قابل ریختن هستند. انتخاب این شاخص به طور عمده به اندازه قطعاتی که قرار است در سیستم الکتروفورزی از همدیگر تفکیک شوند، وابسته است. در محیط الکتروفورزی مولکول های مشابه باسرعت مشابه حرکت می کنند و پس از مدتی در یک نقطه متمرکز می شوند ویک باند یا نوار تشکیل می دهند. بدین ترتیب می توان مولکول های مختلف را از همدیگر جدا کرد (3).

شکل 2-5 دستگاه الکتروفورز
2-6-1 محلول اتیدیوم بروماید
اتیدیوم بروماید با فرمولBr3N20H21C و وزن مولکولی 4/394 گرم بر مول (شکل2-6) به عنوان یک نشان غیر رادیواکتیوبرای تشخیص و دیدن باندهای اسید نوکلئیک در الکتروفورز و در روش جداسازی اسیدنوکلئیک ها بر اساس ژل استــفاده میشود. اتیدیوم بروماید یک ماده قرمز تیره، کریستالی، جامد، غیر فرار، به طور متوسـط محلول در آب، که دارای خاصیــت فلورسنس و رنگ قهوه ای مایل به قرمز در هنگام قرار گرفتن در معرض اشعه UV می باشد. اگر چه یک ابزار مناســبی جهت تحقیق می باشد ولی به خاطر خصوصیات خطرناک آن، بایستی در هنگام جابجایی و دفع به نکات ایمنی و بهداشتی آن توجه نمود .اتیدیوم بروماید یک موتاژن قوی با خاصیت سمی متوسط بعد از یک تماس حاد است. اتیدیوم بروماید میتواند از طریق پوست جذب فوری شود، بنـابراین ممانعت از تماس با این ماده شیـمیایی بسیـار مهم می باشــد. این ماده همچنین محرک پوست، چشم، بینی و دستگاه فوقانی می باشد. یک محلول پایه با غلظت 10 میلی گرم بر میلی لیتر تهیه شده و با غلظت 1میکروگرم بر میلی لیتر مورد استـفاده قرار میگیــرد. ژلــها پس از الکتــروفورز در ظرف جداگانه ای که حاوی محلول اتیدیوم بروماید است، قرار گرفته و پس از شستشو با آب مقطر، آماده عکسبرداری میگردند (12).

شکل 2-6 ساختار اتیدیوم بروماید
2-
6-2 تهیه ژل الکتروفورز
برای انجام الکتروفورز محصولات حاصل از PCR در این تحقیق، از ژل آگارز 3درصد استفاده گردید. برای تهیه ژل، 6گرم آگارز به همراه 200 میلی لیتر بافر TBE 10X در شیشه ریخته شده سپس مواد در مایکروفر حرارت داده شدند تا مایع شفافی به دست آید. محلول در دمای اتاق قرار داده شده تا خنک شود، سپس 8 میکرولیتر اتیدیوم بروماید به محلول افزوده شد. سینی الکتروفورز افقی از دو طرف با اسفنج محکم شد و برروی یک سطح تراز قرار داده شد و محلول با دقت بدون ایجاد هرگونه حبابی در ژل در سینی ریخته شد، سپس شانه های مخصوص سینی در محل خود قرار داده شدند. پس از بسته شدن کامل ژل، اسفنج های اطراف سینی برداشته شده و شانه ها با احتیاط از ژل خارج شدند و سینی به همراه ژل در بافر X TBE 5/0 در دستگاه الکتروفورز افقی قرار داده شد، به صورتی که ژل نیم سانتی متر در بافر فرو رود. قابل توجه است که بـرای تهیه ژل و انجام الکتروفورز نیازمند به بـافر ( X5/0) اسـت. بـرای تهیه cc 1000 بافـر (X5/0) میزان cc50 از بافر TBE X10 را بوسیله آب دیونیزه به حجم cc1000رسانده شد(3).

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   منابع و ماخذ پایان نامهثبت اسناد، حقوق ثبت، اسناد و املاک، قانون نوشته

2-6-3 الکتروفورز محصول PCR
به هر تیوپ DNA حاصل از PCR، 3 میکرولیتر بافر بارگذاری اضافه گردید، سپس از هر نمونه 12میکرولیتر در هر چاهک تزریق شد. پس از اینکه تک تک نمونه ها در چاهک ها قرار گرفتند، در چاهک اولی یا آخری 2 میکرولیتر از DNA ladder (100bp Plus) که از شرکت سیناژن تهیه شد، قرار داده شد. الکتروفورز با ولتاژ 50 ولت بر سانتی متر و به مدت 5 ساعت انجام گرفت. سپس ژل از دستگاه خارج شد و در زیر نور ماوراء بنفش (UV) در دستگاه Gel Logic 212 pro Imaging system (Caresteam, USA) باندها مشاهده شدند و عکس برداری انجام گرفت(شکل2-7).

شکل2-7 دستگاه ژل داک

2-7 تجزیه و تحلیل داده ها:
استفاده از روش نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA جهت بررسی تنوع ژنتیکی، منجر به تولید حجم عظیمی از داده ها میشود. روش های آماری چند متغیره تکنیکی مناسـب جهت تجزیه وتحلیل و مدیریـت این داده ها می باشد، که از بیــن این روش ها تجزیه کلاستر و تجزیه به مختصات اصلی جهت گروه بندی نمونه ها به وفور استفاده می شوند. در هنگام استفاده از نشانگرهای مولکولی، صفات مورد بررسی در واقع باندهایی می باشند که با یک آغازگرتولید می شوندحضور باند با عدد یک و عدم حضور باند باعدد صفر نشان داده می شود. برای تجزیه داده ها از دیدگاه بررسی تنوع ژنتیکی در این نشانگر ماتریس صفر و یک تشکیل می شود.
آنالیز خوشهای با استفاده از نرمافزار POPGEN32 انجام گرفت. دندروگرام ژنوتیپها بر اساس روش UPGMA بدست آمد. تشابه ژنتیکی بین ژنوتیپها با استفاده از ضریب تشابه Nei محاسبه شد(58).

فصل سوم:
نتایج و بحث
3-1 پلیمورفیسم
در این پروژه از 16 ترکیب پرایمری SRAP استفاده شد، از میان آنها 11 ترکیب که نسبت به سایرین چندشکلی قابل توجهی را نشان دادند و دارای باندهای تکرارپذیر و واضح بودند، انتخاب شدند. 5 ترکیب پرایمری ME4-EM6 ، ME3-EM4، ME8-EM18، ME8-EM19 و ME8-EM20 در برخی جمعیتها وضوح و قابلیت تکرار کافی را نداشتند بنابراین کنار گذاشته شدند. همه 11 جفت پرایمر به کار برده شده با موفقیت باندهای قابل تفسیر و خوانا برای گونهی موردنظر ایجاد کردند. برای نمونه یکی از الگوهای باندی بهدستآمده از محصولات PCR به وسیله یکی از آغازگرهای SRAP در شکل 3-1 نشان داده شده است. این شکل به وضوح وجود چندشکلی در DNA بینجمعیتی با توجه به هر نمونه برای پرایمر را نشان میدهد. برای پی بردن به تنوع بین جمعیتها با استفاده از محاسبات آماری و تبدیل دادهها از روی پروفیل باندی حاصل براساس هر آغازگر، کدگذاری به صورت (1) برای حضور باند و (0) برای عدم حضور باند، صورت گرفت که در جدولهای3-1 نمونهای از نتایج نشان داده شده است.

شکل 3-1 الگوی باندی قطعات تکثیر شده برای جفت آغازگر Me2-Em2 به ترتیب از چپ به راست برای نمونه های A1 تا B5

جدول 3-1 نتایج کد گذاری آغازگر Me2-Em2 برای همهی جمعیتها

POP2

POP1
1




B1
1

1


A1
1

1


B2
1

1
1

A2
1

1


B3


1
1
1
A3
1
1



B4


1
1
1
A4





B5
1

1


A5





B6
1

1
1

A6
1




B7
1

1
1
1
A7
1




B8
1

1


A8
1




B9
1




A9
1
1
1


B10
1
1
1

POP4

POP3
1

1


D1
1

1


C1
1

1


D2
1




C2
1

1


D3
1




C3
1




D4
1




C4
1




D5





C5
1




D6
1




C6
1




D7
1




C7
1

1


D8
1

1


C8
1




D9
1

1


C9
1




D10
1




C10

1

1


C11

POP5
1




E1
1




E2
1




E3
1




E4
1




E5
1




E6
1




E7
1




E8
1




E9
1




E10

همهی پرایمرها چندشکلی بالایی را نشان ندادند. فراوانی باندها اختلافاتی در این جمعیتها نشان میدهد. این اختلافات برای نشان دادن کارآمدی به کارگیری پرایمرهای مختلف برای مجزا کردن جمعیتها مهم هستند. در مجموع از 32 قطعه تکثیر یافته به وسیله 11 ترکیب پرایمری، 5 قطعه همشکل و 27 قطعه چندشکل بودند (38/84%). بیشترین تعداد قطعه تکثیرشده 5 عدد و مربوط به جفت آغازگرهای ME2-EM6 و ME2-EM2 بود در حالیکه کمترین تعداد 1 عدد و مربوط به جفت آغازگرهای ME1-EM6 و ME1-EM3 بود و بیشترین وکمترین درصد باندهای چندشکل هم به ترتیب 100% و 50% بود(جدول 3-2) و اندازه قطعات DNA حاصل بین bp 400 – 100 بود.

جدول3-2 نتایج چندشکلی پرایمرهای استفاده شده در این تحقیق
درصد چند شکلی
تعداد قطعات چند شکل
کل قطعات تکثیر شده
پرایمر
100%
1
1
Me1-Em3

100%
1
1
Me1-Em6

100%
5
5
Me2-Em2

50%
1
2
Me2-Em3

6/66%
2
3
Me2-Em4

80%
4
5
Me2-Em6

50%
1
2
Me4-Em1

100%
4
4
Me4-Em3

50%
1
2
Me4-Em6

100%
3
3
Me8-Em4

100%
4
4
Me8-Em6

38/84%
27
32
Total

3-2 بررسی پارامترهای اصلی تنوع ژنتیکی برای همه لوکوسها در جمعیتهای Quercus brantii Lindl.
برای ارزیابی تنوع ژنتیکی در 5 جمعیت Q. brantii پارامترهای پلیمورف ژنتیکی اصلی برای 11 جفت پرایمرSRAP محاسبه شد. Na متوسط شمار آللها در هر لوکوس است و متوسط مقدار آن برای کل نمونهها 84/1 بود، Ne متوسط شمار آلل موثر، کمیتی وابسته به نسبت جایگاه پلیمورف و شمار جایگاه هر آلل و فراوانی باندها است بنابراین میتواند به عنوان ملاکی از تنوع ژنتیکی یک جمعیت یا گونه باشد. شمار آلل موثر یک کمیت برعکس هموزیگوسیتی است. این کمیت شمار آلل است که در فراوانیهای مساوی اتفاق میافتد و هتروزیگوسیتی مشاهده شده در جمعیتها را نشان میدهد. متوسط مقدار این پارامتر برای کل نمونهها 46/1 بود.(I) شاخص تنوع شانون نیز برای کل نمونهها به طور متوسط 69/41% بود(جدول3-3).

جدول3-3 پارامترهای تنوع ژنتیکی همه لوکوسها در کل نمونهها بر اساس مارکر SRAP
I
Ne
Na
تعداد نمونه
نام لوکوس
07/67%
91/1
2
51
ME1/EM6 -1
16/55%
57/1
2
51
ME1/EM3 -1
91/25%
15/1
2
51
ME2/EM6 -1
91/25%
15/1
2
51
ME2/EM6 -2
59%
66/1
2
51
ME2/EM6 -3
99/65%
87/1
2
51
ME2/EM6 -4
0%
1
2
51
ME2/EM6 -5
25/60%
70/1
2
51
ME2/EM4 -1
0%
1
1
51
ME2/EM4 -2
15/57%
62/1
2
51
ME2/EM4 -3
23/45%
38/1
2
51
ME2/EM3 -1
0%
1
1
51
ME2/EM3 -2
25/49%
45/1
2
51
ME8/EM6 -1
81/65%
87/1
2
51
ME8/EM6 -2
22/64%
81/1
2
51
ME8/EM6 -3
67%
91/1
2
51
ME8/EM6 -4
17/14%
06/1
2
51
ME2/EM2 -1
98/21%
12/1
2
51
ME2/EM2 -2
66/56%
61/1
2
51
ME2/EM2 -3
74/13%
06/1
2
51
ME2/EM2 -4
16/55%
57/1
2
51
ME2/EM2 -5
21/46%
40/1
2
51
ME8/EM4 -1
90/68%
98/1
2
51
ME8/EM4 -2
62/51%
50/1
2
51
ME8/EM4 -3
80/31%
21/1
2
51
ME4/EM3 -1
49/51%
49/1
2
51
ME4/EM3

پایان نامه ارشد درمورد
دقیقه، lµ، 100%، Forward پایان نامه ها و مقالات

دیدگاهتان را بنویسید